Bakteriologi

Front 1

Nigrosinfarvning

Back 1

Brugestil at bestemme formen på bakterien. Nigrosin på objektglas --> tilføjkolonimasse --> spredud --> kig imikroskop.

Enten kokker eller stave.

Front 2

Gramfarvning/Gram-farvbarhed

Back 2

Gram-negative: tyndt peptidoglykanlag (0 - 3 nm), 3 lag – yderste lag er hydrofobt, mens det midterste peptidoglykanlag erhydrofilt. Det inderste lag er en plasmamembran. Farves rødt.

Gram-positive: tykt peptidoglykanlag, der forhindrer passagen af hydrofobe molekyler. 2 lag - yderste er det hydrofile peptidoglykanlag, og det inderste er hydrofobt. Farves blåt.

Påvisning: Vand --> kolonimasse --> tørring --> flammefiksering --> farvning med methylviolet (1 minut), vand, lugol (1 minut), vand, 90% ethanol(20 sek), vand, safranin (30 sek) --> mikroskop

Front 3

Forekomst af endosporer

Back 3

Er små, dehydrerede, metabolisk hvilende bakterieformer, som produceresaf voksende bakterier under ugunstige betingelser. Dannelse af sporer kaldes sporulation. Fremtræder ufarvede i Gram-farvningen. Lyser stærkt vedfasekontrastmikroskopi.

Front 4

Hvad ser man på, når man ser på morfologien?

Back 4

Størrelsepå koloni, hvordan ser randen ud, hvordan ser overfladen ud, hvilken farve sesder, er der hæmolyse.

Front 5

Blodagarplade

Back 5

Medie, der bruges til dyrkning af bakterier.Indikativt, fordi man her kan iagttage virkningen af bakterier hæmolytisketoksiner. Non-selektivt, fordi alle typer bakterier kan gro der.

Front 6

Bouillon

Back 6

Medie, der bruges til dyrkning af bakterier.Indikativt, fordi man her kan iagttage virkningen af bakterier hæmolytisketoksiner. Non-selektivt, fordi alle typer bakterier kan gro der.

Front 7

Motilitetsagar (MOT)

Back 7

For at gøre det muligt at vurdere bakteriensmotilitet. Agarkoncentrationen nedsættes til 0,25%.

1. Rent medie

2. Motil bakterie - diffus vækst indtil omkring 1,5 cm. fra bunden.

3. Non-motil.

4. Non-motil

Front 8

O/F glukosemedium (OF, Hugh og Leifson glukosemedium)

Back 8

Anvendes til at bestemme om bakterier nedbryder glukose oxidativt eller fermentativt.

1: Rent medie

2 + 3: Fermentativ reaktion med gasproduktion i lukket rør. E. Coli.

4 + 5: Fermentativ reaktion med gasproduktion i lukket rør. Klebsiella.

Front 9

Nutrient agarplade (NA)

Back 9

Undersøger om bakterier kan vokse uden tilsætning af specifikke vækstfaktorer som blod, serum eller gærekstrakt.

Front 10

MacConkey agarplade (MC)

Back 10

Er både selektiv og indikativ – påviser koliforme bakterier og differentierer andre Enterobacteriaceae.

Indeholder laktose, pepton, galdesalte, NaCl, agar og neutralrødt (nogle gange krystalviolet).

Rødfarvning = postiv for laktoseforgæring.

DET SELEKTIVE ASPEKT: natriumtaurokolat og krystalviolet virker inhibitivt på det fleste Gram positive bakterier. Enterobacteriaceae er galderesistente.

DET INDIKATIVE ASPEKT: natriumtaurokolatomdannes ved laktoseforgæring til taurokolsyre, der danner komplekser med neutralrødt. Neutralrødt er en indikator, der er rød i det sure område (pH<6,8) og gul ved pH >8,0.

Hvis en koloni farves rødt/pink, indikerer det at der er foregået laktoseforgæring.

Front 11

Nitratbouillon

Back 11

Tester nitratreduktion.

Nitrat kan udnyttes af bakterier på to forskellige måder.

1) ASSIMILATORISK NITRATREDUKTION. Nogle bakterier optagerkvælstof fra nitrat og bruger det i biosyntesen = slutprodukt er kvælstofholdige organiske molekyler inde i cellen.

2) DISSIMILATORISKNITRATREAKTION. Nogle bakterier kan bruge nitratmolekylets ilt ved en anaerob respiration = dannelse af ekstracellulære reducerede forbindelser.

Man kan påvise:

1: ingen påviselig reduktion af nitrat --> hvis ingen rødfarvning ved tilsætning af zinkstøv. (billede 1)

2: nitrat reduceres til nitrit, som ophobes --> rødfarvning ved tilsætning af nitritreagens A og B. (billede 2)

3: nitrat reduceres ud over nitrit --> hvis ingen rødfarvning efter tilsætning af nitritreagens A og B og zinkstøv (billede 4)

Front 12

Bevægelighedsprøve med mikroskopi

Back 12

○ Bakterie fra bouillon (eller fra agar på en dråbe vand?)

○ Bestemmelse af om en obligat aerob bakterie svømmer

Front 13

Kaliumhydroxidprøve (KOH)

Back 13

○ Ved slimdannelse er resultatet Gram negativ.

o Baserer sig på det forhold, at G-positive bakteriers cellevæg modstår behandling med KOH, mens de G-negative bakterier lyserer. Det DNA, der frigives vedlyseringen, medfører at væsken bliver slimet og trådtrækkende.

o Lysering = nedbrydning/opløsning af cellemembran.

Front 14

CO2-test med candle jar

Back 14

o Nogle bakterier vokser bedre ved en høj CO2-koncentration. Dette gælder eksempelvis capnofile bakterier.

o Et miljø med lav CO2 opnås ved at inkubere pladerne i en lufttæt beholder med et tændt stearinlys, som sørger for at sænke iltniveauet.

Front 15

Cytokromoxidase

Back 15

○ Har enzymet cytochrom C i sin elektrontransportkæde

o Elektrontransportkæden hos bakterier består af flavoproteiner, cytoproteiner og quinoner. Cytochrom Cer ansvarlig for oxidasereaktionen.

o Nogle bakterier mangler cytokrom C.

o Nogle fenyl-diaminderivater iltes af cytochrom C og farves derved blåt.

Front 16

Katalaseprøve

Back 16

○ Udskiller bakterien enzymet katalase til spaltning af brintoverilte.

o Katalaseenzymeter en oxidoreduktase af hæmoproteintype med 4 hæmgrupper.

o Ligningen:H2O2 + H2O à O2 + 2H2O

o Spaltningaf brintoverilte medfører, at der frigøres ilt.

o Positivearter: Obligat areobe arter, fakultative arter

o Negativearter: obligat anaerobe arter, aerotolerant anaerobe arter

Front 17

Koagulaseprøve

Back 17

○ Bestemmelse af Staphylokokker

o Brugestil at undersøge stafylikokkers evne til at koagulere i stabiliseret plasma.

o Podning af bakteriestamme i bouillon --> kultursættes i kaninplasma àinkubation ved 37 grader --> aflæses for koagulation efter 4 til 24 timer ved at se, om plasmaet er flydende eller stivnet.

På den måde kan det nærmere bestemmes hvilken type staphylokok, der er tale om.

S. aureus ssp. aureus, S aureus ssp. anaerobius, s. pseudointermedius er positive i koagulasetest.

Front 18

Mannitol salt agar (MSA)

Back 18

○ Kødekstrakt

○Selektivt og indikativt medium for stafylokokker, fordi de er Gram-positive

○ Saltkonc. 7,5%, hæmmer de fleste bakterierbortset fra stafylokokker

- S. aureus og S. epidermidis er mannitolfermenterende -- gult

- S. pseudintermedius er mannitolnegativ -- rød(som pladen er)

Front 19

Æskulinblodagar (ÆSC)

Back 19

Bruges til at vise om en organisme kan hydrolisere glukosid aesculin til aesculitin og glucose.

Aesculin er fluoriscerende, men så snart glukosid bliver hydroliseret, mister man det fluoriscerende.

o Æskulitin positivekolonier viser sig ved en let brunfarvning i kanten af kolonien.

(billede = positiv reaktion)

Front 20

Æskulinbouillon

Back 20

- Bruges til at bestemme om en organisme kan hydrolisereæskulin til æskulitin og glukose.

- Består af aeskulin og ferricitrat i peptonvand.

- Efter podning og inkubation aflæses der for sortfarvning – dette skyldes udfældning af æskulitin med ferricitrat til et sort komplex.

Front 21

ONPG (orto-nitrophenyl-beta-D-Galactopyranisoid)

Back 21

- Bruges til at beslutte om en organisme har enzymet beta-galaktosidase

- Testen differentierer mellem laktose-positive og laktose-forsinkede organismer.

- Gulfarvning skyldes fraspaltning af en fenolgruppe, når ONPG af enzymet spaltes til o-nitrofenol, som er gult.

Front 22

Skråserum (Loeffler serum)

Hvad viser testen?

Back 22

- Undersøger bakteriers proteolytiske egenskaber overfor serumproteiner.

- Proteolysen viser sig som en udhulning af mediet (billede 1)

Front 23

Sulfit jern-agar

Back 23

- Indikativt subtrat til påvisningaf sulfit-reducerende klostridier.

- Kan også bruges til påvisning af sulfitreduktion hos Salmonella.

- Reduktion af sulfit til H2S, som reagerer med tilstedeværende Fe+++, hvilket danner sort, uopløseligt FeS, somfælder ud og omkring de sulfitreducerende klostridie-kolonier.

Front 24

Indol

Back 24

Bruges til at påvise om en organisme kan spalte indol fra tryptofan.

Undersøger altså proteinomsætningen.

Rød/pink positiv (billede 2), gullig negativ (billede 3)

Front 25

Hvordan tolkes MR/VP-tests?

Back 25

MR

– Fermentering af glukose er syredannende.

- Et karakteriseringsmedium til bestemmelse af bakteriers slut-pH i et glukoseholdigt peptonvandsmedium (methylrødt prøven) + til undersøgelse af, om bakterierne ved forgæring af glukose danner acetylmethylcarbinol (det sidste påvises ved Voges-Proskauer prøven)

- Ved pH under 5 bliver mediet rødt = methylrødt positivt

- Ved svagere syredannende kulturer forbliver mediet klart = methylrødt negativt

VP

– Fermentering af glukose --> acetoin

- Voges Proskauer udføres efter MR, hvor lidt MR-kultur opblandes med først en alkoholopløsning og derefter en KOH-opløsning. Hvis der i løbet af 30 minutter indtræder rødfarvning, er prøven positiv.

- Positiv VP = tilstedeværelse af acetoin

Front 26

Simmons citrat

Back 26

- Bruges til at bestemme evnen tilat udnytte citrat som eneste kulstofkilde, og ammoniumioner som enestekvælstofskilde.

- Mediet ses fordelt i røret på samme måde somskråagar uden bundsøjle

- Princip: kun bakterier, der kan udnyttecitrat som eneste C-kilde og NH4+ som eneste N-kilde, kan vokse.

- En positiv reaktion viser sig dels ved vækstog dels ved indikatoromslag fra lys grøntil blå (billede 2) som følge af at citronsyren forbruges.

- Blå positiv, grøn negativ (som fra start)

Front 27

Glukose med Durham-rør

Back 27

- Gasdannelse i rør

- Luftproduktion påvises vedopsamling af luften i et minireagensglas (Durhamrøret) anbragt med bunden op adi et rør med glukosebouillon.

Front 28

Urinstof-enzym-medium

Back 28

Urease spaltes til NH3 og CO2 af ureaseproducerende bakterier.

Pink = positiv (basisk)

Gul = negativ

Front 29

BLSF

Back 29

- Vi har brugt det til identificering af E. Coli og Salmonella.

- E. coli er laktosefermenterende og dermed gul grundet sænket pH

- Salmonelle laktosenegativ, dermed ingen farve og syredannelse (rød farve som plade)

- Selektivt princip: brilliantgrønt virker inhibitivt på Grampositive bakterier - derfor er det kun Gramnegative, der kan vokse på mediet.

- Indikativt princip: laktose og/eller sakkarosefermenterende bakterier medfører syreomslag (gul farve) af pH-indikatoren fenolrødt.

Front 30

Slanetz Bartley agar

Back 30

- Selektivt og indikativt for enterokokker.

- Indeholder Na-acid, som er en cytokromgift, der hæmmer væksten af blandt andet Gram-negative bakterier, men også stafylokokker.

- Kolonier af enterokokker farves røde.

Front 31

Lactofenolcottonblue

Back 31

(brugt til alger)

- Fenol: dræber levende organismer.

- Mælkesyre: bevarer de fungale strukturer

- Cotton blue: farver kitin i svampenes cellevægge.

Front 32

Tween-ethanol

Back 32

(i stedet for cottonblue)

- En særlig type syntetisk lipid, hvor glycerol er erstattet med en anden alkohol, poly-oxy-ethylen-sorbitol.

- En fordel ved at benytte tween fremfor genuine lipider til at teste lipaseaktivitet er, at tween er vandopløseligt. Agarmedier med tween er derfor transparente.

Front 33

API 20 E-identifikationssystem

Back 33

- Bruges til en række forskellige tests.

- ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H2S, URL, TDA, IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA

Front 34

PCR-karakterisering

Back 34

- Vi har brugt det til at identificere E. Coli

- Fungerer ved at sammenligne DNA fra prøven med en primer, som slår ud på virulensgen. E.coli findes næsten altid som kommensal i tarmsystemet, og her vil den ikke være ansvarlig for eksempelvis diarre. Hvis den derimod har et virulensgen, vil den forårsage diarre.

- "Multiplex PCR" = man opformerer det bakterielle DNA, deler det ud i brønde, og tilsætter forskellige artsspecifikke horseradish peroxidasemærkede DNA-prober (primere), hvorefter man observerer hvilken prøve der giver et udslag.

Front 35

Malditov-test

Back 35

- Spektofotometri

Front 36

Muller-Hinton saltbouillon-polymoxin bouillon

Back 36

- Næsesvab

- Indeholder stivelse

- Er et non-selektivt, ikke-differentieret medie, som derfor vil danne god grobund for de fleste bakterier.

Front 37

CFU-måling

Back 37

- CFU =colony forming units. o Mantager produktet af OD-målingen og fortynder det fra 0 til 10-5,hvorefter de forskellige koncentrationer fordeles ud på en LA agar. Herefter inkuberespladen ved 37 grader, og dagen efter kan vækstkurven aflæses.

Front 38

Hvordan tolkes denne test?

Back 38

Nitrat-test

Positiv efter tilsætning af sulfansyre og alfa-naftol.

Organismen har reduceret nitrat til nitrit

Front 39

(nitrat-test)

Hvordan tolkes denne test?

Back 39

Nitrat-test

Efter tilsætning af sulfansyre og alfa-naftol.

Farveløs, enten fordi nitrat ikke er blevet reduceret til nitrit, eller fordi det er blevet reduceret til fri nitrogengas.

Front 40

(nitrat-test)

Hvordan tolkes denne test?

Back 40

Nitrat-test

Negativ, efter tilsætning af zinkstøv.

Zinkstøv katalyserer reduktionen af nitrat til nitrit

Front 41

Aesculin-hydrolyse

Hvad viser denne test?

Back 41

1. rør - ikke podet medie

2. rør - positiv test.

I den positive test har organismen hydroliseret æskulin til æskulitin og glukose. Mørkfarvningen skyldes at ferric citrat reagerer med æskulitinen.

Front 42

Alfa-methyl-D-Mannose.

Hvad viser denne test?

Back 42

Tester om en organisme kan fermentere alfa-methyl-D-mannose under dannelse af syre.

Indikatoren er bromthymolblåt, og testen farves gul ved lav pH.

Derfor er 2. rør en positiv test.

Front 43

Fermenteringstest

Hvad viser testen?

Back 43

Bestemmer om en organisme kan fermentere en bestemt kulhydrat under dannelse af gas og syre.

Bromthymolblåt bruges som indikator, og farves gul når pH er lav.

Gas, der produceres, samles i et Durhamrør.

1. rør = upodet medium

2. rør = positiv test

3. rør = negativ test

Samme test kan udføres for laktose og dulcitol

Front 44

Methylrødtest.

Hvad viser testen?

Back 44

Bruges til at undersøge, om en organisme kan producere og vedligeholde syreprodukter, der fremkommer efter fermentering af glukose.

1. rør = upodet medium

2. rør = positiv test

3. rør = negativ test

Kulturen inkuberes i et Clark og Lub medium. Halvdelen af dette bruges til methylrødt-test og den anden halvdel bruges til VP-test.

Front 45

Oxidation-fermentation

Hvad viser testen?

Back 45

1. rør = upodet medium

2 + 3 = positiv. Gulfarvning i 2 --> oxidation. 3 er et lukket rør --> derfor ingen oxidation.

4 + 5 = negativ. Blå alkalinreaktion i 4 påviser en baseudskillelse --> derfor ikke en syreudskillelse.

Front 46

Hvis man i en OF-test har to rør, hvoraf det ene er forsejlet med vaseline (et lukket rør) og det andet rør er åbent, hvor vil der så foregå hhv. fermentation og oxidation?

Back 46

Åbent rør: oxidation under produktion af syre

Lukket rør: fermentation under produktion af syre