3 Deeken Funktionelle Genomik Ii

Front 1

Wie funktioniert die Restriktion Enzym Verdauung und Ligation?

Back 1

- über Sticky End Cloning

-> PCR amplifiziertes Fragment wird verdaut (REase) -> Entstehung von Sticky Ends

-> Gespaltenes Fragment kann in einen Plasmid Vector ligiert werden (durch T4 DNA Ligase)

Front 2

Vor- und Nachteile von RE/Ligation Cloning?

Back 2

Vorteile:

- kostengünstig

- kein Cloning Kit notwendig

Nachteile:

- Abhängig von der Restriktionsenzym Angriffsstelle

. Zeitaufwändig

Front 3

Was ist TOPO-Cloning?

Back 3

TOPO-Plasmide werden durch Restriktionsverdau linearisiert und anschließend kovalent mit einer Topoisomerase gekoppelt, die die Ligation eines PCR-Produkts bewirkt und daher keine Ligase mehr erfordert

Front 4

Was ist die TA-Klonierung?

Back 4

Eine Art der TOPO Klonierung

- ebenfalls literarisierte Vektoren, die einen T 3' Überhang haben

Front 5

Was ist der Vorteil von TOPO Klonierung gegenüber RE Verdau & Ligation?

Was haben beide für einen Nachteil?

Back 5

Zeitsparend

-> RE: 2 Tage / TOPO: unter 1 Tag

Nachteil beider Methoden:

keine gezielte Orientierung des Inserts im Vektor

Front 6

Was ist die Gateway Klonierung?

Back 6

Ein Entry Clone transferiert Gen in viele verschiedene Zielvektoren Vektoren um viele verschiedene Expressions Klone zu erhalten

Front 7

Was ist ccdB?

Back 7

- Suicide Gen für E. coli

- ccdB Protein interferiert mit DNA gyrase und hemmt somit Wachstum der meisten E. coli Arten

Weil destination Vektor in Gateway Klonierung ccdB Gen enthält muss es in E. colis transformiert werden, die eine Gyrase Mutation aufzeigen

Front 8

Was ist der Vorteil von Gateway Klonierunng?

Back 8

Extrem effiziente Konieriungsstrategie

Front 9

Was sind Charakteristiken, die ein binärer Vektor der Gateway Klonierung haben muss?

Back 9

Left Border und Right Border

und attR sides

Front 10

Was ist die USER Klonierung?

Back 10

Uracil-Specific-Excision-Reaction

- Generiert eine single Nukleotid Lücke bei Uracil

- ist unabhängig von Vektortyp und Fragmentgröße

Front 11

Was ist das Prinzip hinter der USER Klonierungstechnik?

Back 11

Generation eines 8 Nukleotid 3' Überhangs (langes Sticky End) auf dem Vektor und dem PCR Produkt um stabiles Produkt zu erhalten

Front 12

Vorgehensweise von USER Cloning?

Back 12

1. Obstruktion eines Vektors

-> Vektor wird mit PAC verdaut (schneidet Teil aus Vektor raus)

2. Generierung eines USER PCR Produkts

-> benötigt 8 Nukleotid 3' Überhang und ein A an Position 8

3. Insertion des PCR Produkts in den Vektor

Front 13

Gibson Cloning

Back 13

- erlaubt Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente unabhängig von Länge oder Enden Kompatibilität

- Verbindet mehrere überlappende DNA-Fragmente in einem Tube bei isothermer Reaktion

- braucht kein Uracil oder andere extra Nukletotide um Lücken zu füllen

Front 14

Prinzip der Gibson Klonierung?

Back 14

- zu verbindende DNA-Fragmente werden durch PCR amplifiziert und mit assembly Enzymen (3 Stück) inkubiert. -> Mixtur wird in Bakterien transformiert

Front 15

Welche 3 Assembly Enzyme für Gibson Klonierung?

Was machen diese Enzyme?

Back 15

1. T5 Exonuklease -> erstellt Einzelstrang 3' Überhang für Anlagerung der Fragmente, die Komplementäre Enden tragen

2. DNA Polymerase -> füllt die Lücken in jedem Angelagertem Fragment

3. DNA Ligase füllt Löcher der entstandenen DNA

Front 16

was sind forward und was sind Reverse Primers?

Back 16

Front 17

Genome Editing - 4 Familien von engineered Nukleasen?

Back 17

1. Zinc Finger Nukleasen (ZFNs)

2. Transkriptions Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

3. CRISPR/Cas System

4. Honing Endonucleases

Front 18

Was sind Zinc Finger Nukleasen?

Back 18

- künstliche Restriktionsenzyme

- generiert durch Fusion einer Zinc Finger DNA-Bindungsdomäne mit einer Dna-Teilinns Domäne einer Endonuklease

- kann für präzise Änderung des Genoss von höheren Organismen genutzt werden

- können für bestimmte DNA-Sequenzen erstellt werden

Front 19

Zinc Finger Nukleasen - Woher kommt die DNA Bindungsdomäne?

Back 19

von Zinc Finger Transkrisptionsfaktoren

Front 20

An wieviele Nukleotide kann eine Zinc Finger Bindungsdomäne binden?

Back 20

an 3 Nukleotide

Front 21

Was ist und macht FokI?

Back 21

- ist eine Typ IIS Restriktionsendonuklease

- besitzt eine DNS-Bindungsdomäne (N-Terminal) und eine nicht spezifische DNA Teilungsdomäne (C-Terminal)

- Bindet an spezifische Sequenz der DNA und aktiviert Teilungsdomäne, welche DNA an einem Strang 9 Nukleotide von Bindungsdomäne entfernt teilt und anderen Strang 13 Nukleotide davon entfernt teilt

--> Nutzung der Teilungsdomäne in Kombination mit Zinc Finger Nukleasen

Front 22

Was benötigt man bei ZFNs um double Stranded Breaks (DSBs) der DNA zu erzielen?

Back 22

- Zwei Kopien einer 3 Finger ZFN, die eine 9 BP lange Sequenz erkennen

--> Somit hat sie eine 18 Basenpaar Erkennungssequenz -> genug um einmalig in Genomen von Pflanzen und Säugetieren vorzukommen

Front 23

Wie werden erzeugt DSBs repariert?

Back 23

Durch zelteigene Mechanismen

Front 24

Welche zwei Wege der DSB Reparatur gibt es?

Back 24

- Homologe Rekombination (HR)

- Nicht Zoologe Rebkombination (NHEJ)

Front 25

Was ist TALE?

Back 25

- Transcription Activator Like Effectors aus Pflanzenpathogen Xanthomonas spp.

- Proteine, die in Eukaryotische Zelle durch Typ II Sekretionssystem sekretiert werden

- induzieren Transkription verschiedener Gene

Aufbau:

- N-Terminales Typ III Sekretions Signaldomäne

- zentrale Region besteht aus 10-18 sehr ähnlichen Tandem Repeats, von denen jeder r34 Aminosäuren lang ist

- C-Terminale Effektor Domäne

Front 26

TALE - Welche Position in den Tandemrepeats definiert die Bindung zu Nukleotiden?

Back 26

Position 12 und 13

Front 27

2 Große Klassen der künstlichen TALE Proteine

Back 27

- TALE-TFs -> Fusion mit Transkriptionsfaktordomäne VP64 welche ein Gen des Interesses aktiviert

- Fusion zu einer nicht sequenzspezifischen nukleares (FokI) -> TALE Nuklease (TALENS) -> Paare einer TALEN können erstellt werden, um an spezifische DNA Sequenzen zu binden und in der Lage sind FokI Dimmer zu bilden -> Erzeugung eines DSB

Front 28

Was sind CRISPRs und Cas?

Back 28

CRISPR:

- = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

- DNA Loci, welche kurze Repeats enthalten

- jedes Repeat gefolgt von spacer DNA

- Spacer erkennen und schneiden exogenes genetisches Material analog zu RNAi in eukaryotischen Organismen

Cas:

- = CRISPR Associated

- Gene, die für Endonukleasen codieren

- CRISPR/Cas System ist ein prokaryotisches Immunsystem, dass Resistenz gegen exogenes Material zeigen (form der erworbenen Immunität)

- Durch CAs9 Protein und geeignete RNAs (gRNAs) kann das genom an jeder gewünschten Stelle geschnitten werden

Front 29

Struktur eines CRISPR-Cas Locus?

Back 29

Front 30

Welches ist das meist genutzte CRISPR-Cas System?

Back 30

Typ II

Front 31

Was ist das PAM Motiv?

Back 31

= protospacer adjacent motif

- Ziel Sequenz Spezifität ist vermittelt durch 20 Nukleotid Space Region in der crRNA, welche komplementär zur Ziel DNA und einem 2 Nukleotid Motiv (NGG, N=A,C,G,T) ist -> Zielort der DNA wird geschnitten

Front 32

Funktionsweise des CRISPR-Cas Systems?

Back 32

- CAs9 Protein bindet an crRNA und formt RIbonukleoprotein störenden Komplex. crRNA Sequenz leitet Komplex zu einer komplementären Sequenz in der Ziel-DNA. An crRNA Sequenz befindet sich eine Ziel-DNA bindende Sequenz (crRNA Spacer). crRNA Spacer ist variabler Adapter -> bindet Ziel DNA Sequenz.

DNA wird nahe der Bindungsstelle geschnitten

Front 33

2 Typen von RNA, die Funktion der RNA Interferenz (RNAi) haben?

Back 33

1. Micro RNA (miRNA) - einzelsträngig gefaltet

2. small interfering RNA (siRNA), trans-acting siRNA (tasiRNA) - lang doppelstränig

Front 34

Wo kommen siRNAs und miRNAs her?

Back 34

- siRNA: exogene und endogene RNAs, ursprünglich aus Virus, Transgenen oder Transposons

- miRNA: nur endogen transkribierte mRNA von nicht Protein kodierenden Genen

Front 35

2 RNAi basierte Silencing Pathways?

Back 35

1 TGS (transkriptional gene silencing)

- DNA methylation

- Heterochomatin Formation

2 PTGS (post transcriptional gene silencing)

- message cleavage

- inhibition der Translation

Front 36

Welche pathways können siRNAs benutzen?

Back 36

PTGS durch mRNA cleavage

und

TGS Funktion durch induzierte DNA Methylierung im Nukleus

Front 37

Beispiele von natürlichen Funktionen der siRNA?

Back 37

- Transposon silencing in Arabidopsis Keimbahn

-> verhindern Transposon Mobilisierung durch DNA-Methylierung

- vermitteln die Reparatur von DNA DSBs

-> benötigt dazu RNA Pol IV, RNA-abhängige RNA Pol und Dicker like Proteine

- vermitteln Regulation der Genexpression (Bsp. Salzstress)

- Funktion der Degradation von anomalen Transkription

-> bspw. wenn 3' Poly(A) oder 5' Cap fehlt

Front 38

Beispiele von natürlichen Funktionen der miRNA?

Back 38

- Regulieren Normales Pflanzenwachstum

Front 39

Was sind mögliche Anwendungen der RNA Interferenz?

Back 39

- RNAi Technologie ermöglicht erstellen von Custom Knockdown Pflanzen

- Erlaubt das Silencing eines spezifischen Gens oder ganzer Genfamilien

- eine Transformation kann unterschiedliche Pflanzen Linien mit unterschiedlichen Leveln des Silencing bringen

- Weniger gesilencte Pflanzen erlauben das Überleben von Linien, für die ein Kompletter Verlust der Funktion letal wirken können

Front 40

Was können Gründe für die Verwendung für Silencing von Tranigeren sein?

Back 40

- Multiple T-DNA (Agrobakterium schleust mehrere T-DNA ins Genom ein, mit Unterschiedlicher Orientation)

- GFP silencing mit einer Antisense RNAi -> PTGS

Front 41

siRNAs und Promoter?

Back 41

siRNAs können Promoter methylieren und somit Expression des gens verhindern (-> TGS)

Front 42

was sind amiRNAs?

Back 42

Artificial miRNAs

- können konstruiert werden um unterschiedliche endogene mRNAs zu reduzieren

- können effizient einzelne oder multiple gene silencen

- Ähnliche Effekte wenn sie unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoter expressiert werden