Cellmolekylär (Rek Dna)

Front 1

Vad är rekombinant DNA?

Back 1

DNA molekyler som består av genetiskt material från flera olika källor (förekommer inte naturligt)

Front 2

Vad är PCR (polymerase chain reaction)?

Back 2

- amplifiering (många kopior) av templat

Front 3

Namnge ett användningsområde för PCR

Back 3

isolering av gensekvenser från olika organismer för att jämföra dem

Front 4

Vad behöver man för att kunna utföra PCR? (6 st)

Back 4

- DNA templat
- Nukleotider
- Primers
- DNA polymeras
- Buffertlösning
- värmekälla

Front 5

Vad består en nukleotid av (RNA och DNA)? (3 st)

Back 5

- fosfatgrupp
- kvävebas (A/ T(U)/ C/ G)
- pentossocker (2' -OH i RNA/ H i DNA)

Front 6

Vilka kvävebaser finns hos DNA? (namnge även kvävebas grupper)

Back 6

- pyrimidiner (tymin, cytosin)
- puriner (adenin, guanin)

Front 7

Vilka kvävebaser finns hos RNA? (namnge även kvävebas grupper)

Back 7

- pyrimidiner (uracil, cytosin)

- puriner (adenin, guanin)

Front 8

Vad är skillnaden mellan pyrimidiner och puriner? (1 skillnad)

Back 8

- pyrimidiner - en socker ring

- puriner - två socker ringar

Front 9

Vad är primers och vad består den av?

Back 9

Den är startpunkt för syntiseringen som består av oligonukleotider (18-25 nukleotider esDNA) med en specifik sekvens.

Front 10

Vad har primrarnas för mältpunkten (Tm)?

Back 10

50-60 grader (40-60% GC)

Front 11

Vad är definition på smältpunkt?

Back 11

Den temperatur där hälften av basparen separerat.

Front 12

Hur många vätebindningar har A-T resp. G-C?

Back 12

A-T har 2 vätebindningar
G-C har 3 vätebindningar

Front 13

Vad är primer dimers?

Back 13

Det är när primrarna binder till varandra

Front 14

Vad är hair pins?

Back 14

Det är när primer binder sig själv

Front 15

Vad ska man undvika när man designa primers? (2 st)

Back 15

- hair pins
- primer dimers

Front 16

Skriv sekvensen på PCR-primers (5 nt primers) ett 25 bp DNA fragment motsvarande nukleotid 4 till 22

( ATTCCGGGAATTTTCCCGGGTTAAT )

Back 16

Uppström: 5'-CCGGG-3'
Nedström: 5'-AACCC-3'

Front 17

Vad är DNA polymeras?

Back 17

DNA polymeras är ett enzym som binder till primrarna och bygger nytt dsDNA genom att fästa in fria nukleotider

Front 18

Var kommer Taq-polymeraset ifrån?

Back 18

från bakterien Thermofilus aquaticus och lever vid varma svavelkällor.

Front 19

Varför använder man Taq-polymeraset under PCR?

Back 19

För att det är värmetåligt

Front 20

Vad behöver Taq-polymeraset för att den ska kunna påbörja transkription under PCRen?

Back 20

Det behöver fri-OH ände i 3'

Front 21

Varför buffertlösning till PCR?

Back 21

för att reaktionen ska fungera optimalt

Front 22

Beskriv olika steg under PCRen (3 steg)

Back 22

- Denaturering
- Annealing
- Elongering

Front 23

Förklara om vad som händer under hot start ( 3 steg)

Back 23

- utförs innan första denaturering
- 95 grader i 3 min
- antikroppar binder till Taq-polymeraset för att hindra från att vara aktivt för tidigt

Front 24

Förklara om vad som händer under denaturering (2 steg)

Back 24

- dsDNA värms upp
- 95 grader i 30 sek

Front 25

Förklara om vad som händer under annealing (2 steg)

Back 25

- primrarna basparar till esDNA
- 55 grader i cirka 30 sek.

Front 26

Definiera hybridiseringen

Back 26

Basparning mellan två komplementära nukleinsyrasträngar

Front 27

Förklara om vad som händer under elongering (3 steg)

Back 27

- polymeraset binder in till primrarna
- syntetiserar en ny dsDNA
- 72 grader i 1 min

Front 28

Hur syntetiseras man agaros gelen? (3 steg)

Back 28

- agarospulver blandas med TAE buffert
- smälts i mikron
- gjuta en gel med SYBR safe

Front 29

Vilken laddning har DNA molekyl?

Back 29

Negativt pga. fosfatgrupperna

Front 30

Vad består laddningsbuffert av och vad har de för funktion? (2 st)

Back 30

- färg (STBR safe)
för att visualisera genom att fluorescerar
- glycerol
för att provet ska sjunka ner i brunnen

Front 31

Vilka problem kan uppstå efter man har kört PCRen? (3 st)

Back 31

- ospecifik amplifiering (fragment av fel storlek eller primrarna bundit in på andra ställen än förväntat)
- primer dimers
- introducera fel nukleotider under elongering

Front 32

Vilken metod använder man för att mäta exakt mängd DNA i provet?

Back 32

spektrofotometri (mäter mängd och renhet)

Front 33

Under vilken nanometer absorberas DNA mest ljus?

Back 33

260 nm

Front 34

Under vilken nanometer absorberas protein mest ljus?

Back 34

280 nm

Front 35

Förklara metoden för Konventionell PCR (kortfattat om vad den gör)

Back 35

två primrar används för att amplifiera upp en stor mängd kopior från ett templat

Front 36

Förklara metoden för Reverse transcriptase (RT) PCR (kortfattat om vad den gör)

Back 36

fungerar som PCR men man utgår från RNA som görs till cDNA

Front 37

Förklara metoden för Quantitative (Q)PCR (kortfattat om vad den gör)

Back 37

mäta mängden av en DNA-sekvens i provet mha. fluorescent infärgning

Front 38

Förklara metoden för qRT-PCR (kortfattat om vad den gör)

Back 38

mängden RNA i ett prov kvantifieras genom att det görs om till cDNA och sedan mäts mängden som fluorescens

Front 39

Vilket enzym används under qRT-PCR?

Back 39

omvänt transkriptas (mRNA till cDNA)

Front 40

Vad mäter man under qRT-PCR?

Back 40

man mäter mRNA nivåerna för en viss gen. (antalet cDNA kopior i proportion till ursprungsnivån av mRNA)

Front 41

Vad är Ct-värde (cycle threshold)? (qRT-PCR)

Back 41

Fluorescensen passerar ett värde som är 10 ggr högre än bakgrunden.

Front 42

Vad är House-keeping gener?

Back 42

Det är gener som finns i alla celler och som är nödvändiga för normala funktionen

Front 43

Vad är DNA kloning?

Back 43

en amplifiering (kopiering) av ett specifikt DNA fragment till flera exakta kopior

Front 44

Vad är skillnaden mellan kloning och PCR?

Back 44

Kloning utförs av bakterier medan PCR utförs av maskin

Front 45

Vad är fördel att använda kloning ist för PCR? (3 st)

Back 45

- får ut fler kopior
- amplifiera längre fragment
- färre mutationer (eftersom bakterien kan fixa felaktiga nukleotider)

Front 46

Vad är plasmid DNA?

Back 46

Det är extrakromosomalt cirkulärt dsDNA i bakterier

Front 47

Vad är vektor?

Back 47

Redskap som används vid kloning. Gör det möjligt att föra in DNA-fragment i bakterier och eukaryota celler (plasmid)

Front 48

Vad innehåller vektorer? (4 st)

Back 48

- ORI (origin of replikation)
- MCS (multiple cloning site)
- Reportergen (ex. LacZ)
- Selektionsgen (ex. ampicillinresistensgen)

Front 49

Vad är ORI (origin of replikation)?

Back 49

Det är start site av replikation för DNA-plasmiden.

Front 50

Vad är MCS (multiple cloning site)?

Back 50

Det är den region där man för in sitt DNA-fragment av intresse.

Front 51

Vad är reportergen?

Back 51

Gen som används för att identifiera de celler som innehåller plasmiden.

Front 52

Vad är selektionsgen?

Back 52

Gen som ger resistens mot antibiotika. Gör att man kan selektera ut celler som inte innehåller plasmiden.

Front 53

Vad gör nukleaser?

Back 53

den klyver bindningarna mellan nukleotider.

Front 54

Vad gör endonukleaser och exonukleaser?

Back 54

Endonukleaser klyver innuti en DNA-sträng

Exonukleaser klyver i ändarna

Front 55

Vad gör Restriktionsenzym?

Back 55

den klyver båda strängarna i DNA genom

Front 56

Vad är Restriktionsenzym?

Back 56

Det är endonukleas som produceras av bakterier

Front 57

Vad är Restriktions siter?

Back 57

Det är 4-8 bp långa specifika sekvenser. Oftast är ett palindrom (ex. ANNA)

Front 58

Vad använder bakterier Restriktionsenzymer till? (1 st)

Back 58

bryter ner främmande DNA (som immunförsvar)

Front 59

Vad gör Modifierande enzym?

Back 59

modifierar bakteriernas egen genom. Förhindrar att restriktionsenzymet inte klyver det egna DNAt.

Front 60

Vad har EcoRI för restriktionsenzymstyp?

Back 60

Sticky ends

Front 61

Vad har EcoRV för restriktionsenzymstyp?

Back 61

Blunt ends

Front 62

Vad är Sticky end? (restriktionsenzym)

Back 62

klyvning ger ojämna kanter (överhäng)

Front 63

Vad är Blunt end? (restriktionsenzym)

Back 63

klyvning ger jämna kanter

Front 64

Namnge 2 fördelar med Sticky end (restriktionsenzym)

Back 64

- passar bara ihop med likadana överhäng
- hög specificitet vid ligering

Front 65

Namnge 2 nackdelar med Blunt end (restriktionsenzym)

Back 65

- kan paras ihop med alla jämna kanter
- Låg specificitet vid ligering

Front 66

Vad är ett Ligas?

Back 66

Det är ett enzym som för ihop PCR-fragmentet med den klyvda vektorn

Front 67

Vad kräver Ligas för att kunna ligera ihop två PCR-fragmenter? (2 st)

Back 67

- kräver ände med fri 5' fosfat
- ATP som energikälla

Front 68

Vad är Fosfatas?

Back 68

Det är ett enzym som ta bort fosfatgruppen i 5'.

Front 69

Vad är Transformation?

Back 69

Processen där en bakterie tar upp en plasmid genom att värmebehandlar eller elchockar bakterierna.

Front 70

Vad är Kompetenta bakterier?

Back 70

Det är bakterier som specialbehandlats för att effektivt kunna ta upp plasmider.

Front 71

Vad är Selektion?

Back 71

selekterar ut de bakterier som tagit upp en plasmid

Front 72

Vad är Blå-vit screening?

Back 72

Det är metod som man kolla på vilka bakterier som har tagit upp PCR-fragmentet.

Front 73

Vad kodar LacZ för?

Back 73

Den kodar för Beta-galaktosidas

Front 74

Vad klyver Beta-galaktosidas?

Back 74

Den klyver X-gal (sockermolekyl + indolgrupp)

Front 75

Vilken färg har bakterien kolonin med klyvt X-gal? Vad tyder det på?

Back 75

blått. Det tyder på att ingen PCR-fragment har tagits upp.

Front 76

Vad bygger Sanger-sekvensering på och vad krävs det?

Back 76

- bygger på DNA syntes
- kräver fri 3' OH grupp (dNTP)

Front 77

Vilka material krävs för Sanger-sekvensering? (6 st)

Back 77

- taq-DNA polymeras

- sekvenseringsprimer med fri 3'-OH

- templat

- dNTP

- ddNTP

- buffert

Front 78

Hur detekterar man nukleotider i Sanger-sekvensering?

Back 78

- storleksseparering via kapillärelektrofores och laserexcitation av de fluorescerande grupperna som avläses som det resulterande emitterade ljuset

Front 79

Vad är en kapillärelektrofores?

Back 79

Det är elektrofores i tunna rör där storleksseparation sker genom interaktion med väggarna i kapillären.

Front 80

Hur presenteras man resultatet av Sanger-sekvensering?

Back 80

elektroferogram (Y-axel: relativ fluoroscence units) (X-axel: antal nukleotid)

Front 81

Vad gör Pyrosekvensering?

Back 81

bestämma nukleotidordningen i en specifik del av DNA

Front 82

Hur går Pyrosekvenseringen till? (5 steg)

Back 82

- mäter det avspjälkade pyrofosfatet som bildas efter varje adderad nukleotid.

- DNA polymeras ger DNA-syntes och vid nukleotid-inkorporering bildas pyrofosfat, PPi

- ATP-sulfyrlas omvandlar PPi till ATP

- ATP ger energi till luciferas's omvandling av luciferin till oxyluciferin och ljus bildas som ger upphov till pyrogram

- Apyras bryter ned ATP så att reaktionen kan starta om på nytt